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EPI300 Chemically Competent Cell

價格:1000元

聯系方式:I47-825O-882O

買家導航

EPI300感受態細胞基本信息

出品公司: 生物風
感受態細胞名稱: EPI300  Ultracompetent cells;EPI300
菌種類型: E.coli
產品規格: 10X100 微升
轉化效率: 大于1X10的9次方
基因型: F – mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZ∆M15 ∆lacX74 recA1 endA1 araD139 ∆(ara,leu)7697 galgalK λ –rpsnupG trfdhfr.
抗性: 無抗性
質粒轉化條件: 42 ℃熱激
生長條件: 37 ℃,  有氧
用途: 非毒性蛋白表達。
儲存條件: -80 ℃或者更低溫度保存,避免反復凍融。

感受態細胞特點和簡介

EPI300細胞含有一個突變的trfA基因,該基因表達出的蛋白產物可以促進含有ori V復制子的質粒的高拷貝擴繁,誘導劑Ⅰ可以誘導trfA基因的表達。當含有ori V復制子質粒的EPI300細胞在LB/2YT或SOB培養基中生長時,trfA基因的表達被抑制,ori V復制子質粒的拷貝數維持在很低的水平;當在培養基中加入誘導劑Ⅰ,ori V復制子質粒的拷貝數可維持在很高的水平,提高了質粒產量。因此EPI300菌株可以降低ori V復制子質粒的拷貝數,特別適合于各種不穩定 DNA 或毒性基因的克隆。 [mrr-hsdRMS-mcrBC]基因型使EPI300菌株適合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA(例如:哺乳動物基因組DNA)。recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩定和高純度質粒DNA的提取。lacZΔM15 標記的存在使EPI300可用于藍白斑篩選,rpsL賦予其鏈霉素抗性。EPI300感受態細胞經特殊工藝制作,pUC19質粒檢測轉化效率可達3×108cfu/μg DNA。

感受態細胞制備方法

生物風在氯化鈣感受態細胞制作方法的基礎上進行了改良,采用最新的二價錳法感受態細胞制備方法,制備得到EPI300超級感受態細胞(Ultracompetent cell)。轉化效率是常規氯化鈣制備法的10倍。
 

感受態細胞操作方法

 
1. 取EPI300感受態細胞置于冰浴中,如需分裝可將剛融化細胞懸液分裝到無菌預冷的離心管中,置于冰浴中。
     注意:一次轉化EPI300感受態細胞的建議用量為 50-100μl,可以根據實際情況分裝使用。應注意所用DNA 體積不要超過感受態細胞懸液體積的十分之一。以下實驗以100μl EPI300感受態細胞為例。 
 
2. 向EPI300感受態細胞懸液中加入目的 DNA (100μl 的感受態細胞能夠被1 ng 超螺旋質粒DNA 所飽和),輕彈混勻,在冰浴中靜置30 分鐘。  
 
3. 將離心管置于 42 ℃ 水浴中放置60-90秒,然后快速將管轉移到冰浴中,使EPI300感受態細胞冷卻2-3分鐘,該過程不要搖動離心管。
 
     注意:此步驟也可將離心管置于室溫進行,時間不需十分準確,夏季或室溫較高時,可放置5-8分鐘左右;如果室溫較低,可延長時間至8-15分鐘左右。條件允許建議使用 42 ℃ 熱激方法。  
 
4. 向每個離心管中加入900 μl無菌的SOC 或LB 培養基(不含抗生素),混勻后置于37 ℃搖床振蕩培養45 分鐘(150 rpm),目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達,使菌體復蘇。 
 
5. 將離心管內容物混勻,吸取100μl已轉化的EPI300感受態細胞加到含相應抗生素的SOB或者LB 固體瓊脂培養基平板上,用無菌的彎頭玻棒涂布器或玻璃珠將細胞均勻涂開。將平板置于室溫直至液體被完全吸收后,倒置平板,37 ℃培養12-16 小時。 
     注意:涂布用量可根據具體實驗來調整。如轉化質?偭枯^多,可取更少轉化產物涂布平板;反之,如轉化的質?偭枯^少,可取200-300 μl轉化產物涂布平板;對于連接產物的轉化菌液,可以通過離心(4000 rpm,2分鐘)后倒掉大部分培養液上清,吹打懸浮菌體后,將其涂布于一個平板中。  
 
6. 涂布剩余的菌液可置于 4℃冰箱中保存,如果次日的轉化菌落數過少,可以將剩下的菌液再涂布新的培養平板。

感受態細胞注意事項

1. EPI300感受態細胞應保存在-70 ℃,不可反復凍融和放置時間過長,以免降低感受態細胞的轉化效率。
 
2. 進行轉化操作時,應根據相應的溫度及無菌條件的要求進行。
 
3. 為防止轉化實驗不成功,可以保留部分連接反應液,以重新轉化,將損失降到最低。
 
4. 用于轉化的連接產物或質粒的體積不能超過感受態細胞體積的15%.  
 
5. 質粒超過7.5 kb后,隨尺寸的增加轉化效率會下降,質粒的尺寸超過10 kb時,在大腸桿菌增殖過程中也可能會出現質粒缺失現象;  
 
6. 用于轉化的質粒量在0.1 pg~50 ng間的效果最好,超過50 ng質粒時,平板上單克隆數目會增加,但是轉化效率會下降。 
 
7. 42 ℃熱擊時間與離心管的厚度、菌液的體積、轉入片段的大小直接相關,一般建議熱擊60-90秒,熱擊時間不宜超過90秒,否則轉化效率會下降很快; 
 

EPI300感受態細胞特點和簡介

EPI300感受態細胞制備方法

EPI300感受態細胞操作方法

EPI300感受態細胞注意事項

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